Naukowcy z Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej we współpracy z firmą Genentech, znaleźli sposób na zatrzymanie rozpadu umierającej komórki. Badacze wykorzystali pory powstające w jej błonie, by wprowadzić do środka związki hamujące pyroptozę – gwałtowną, zapalną śmierć komórkową. Wyniki ich badań zostały opublikowane na łamach prestiżowego czasopisma „Nature”.

Publikacja jest efektem współpracy zespołów prof. Marcina Poręby z Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej oraz prof. Vishvy M. Dixita z Genentech – jednej z wiodących firm biotechnologicznych na świecie. Obaj badacze są autorami korespondencyjnymi artykułu.

Równorzędny, kluczowy wkład w badania miały dwie autorki: dr inż. Katarzyna Groborz (która po obronie doktoratu na PWr objęła staż podoktorski w Genentech) oraz Melissa E. Truong. W pracach uczestniczyły również doktorantki prof. Marcina Poręby – Julia Nguyen i Małgorzata Kalinka, które odpowiadały za syntezę inhibitorów i ich analizę kinetyczną. Prof. Marcin Drąg jest twórcą unikalnej technologii HyCoSuL, użytej do określenia preferencji badanych kaspaz.

Jak zatrzymać zapalną śmierć komórki?

Pyroptoza to kontrolowany mechanizm samounicestwienia komórki połączony z wywołaniem silnej reakcji zapalnej, stanowiący jeden z elementów obrony organizmu przed zakażeniami.

– W jej przebiegu aktywowane są enzymy nazywane kaspazami prozapalnymi. U człowieka są to kaspazy-1, -4 i -5 – wyjaśnia prof. Marcin Poręba. – Działają jak molekularne nożyczki: przecinają białko o nazwie gasdermina D. Jego uwolnione fragmenty łączą się i tworzą duże pory w błonie komórkowej.

Przez tak powstałe otwory na zewnątrz przedostają się m.in. cytokiny IL-1β oraz IL-18, które alarmują układ odpornościowy. Komórka zaczyna pęcznieć, aż w końcu ulega rozpadowi. Choć reakcja ta pomaga zwalczać zagrożenia, problem pojawia się w momencie, gdy pyroptoza staje się zbyt agresywna – może wówczas prowadzić do niszczenia zdrowych tkanek i groźnych stanów zapalnych.

Pory jako droga do wnętrza komórki

Naukowcy od lat badają możliwość hamowania kaspaz. Dotychczasowe próby kliniczne z wykorzystaniem łatwo przenikających do komórek inhibitorów nie przyniosły jednak oczekiwanych rezultatów. Powodem była toksyczność lub niska skuteczność tych związków. Docierały one też do zdrowych komórek, hamując kaspazy uczestniczące w innych ważnych procesach.

Zespoły PWr i Genentech zamiast tworzyć inhibitor, który jak najłatwiej przenika przez błony, postawiły na związki bardzo słabo wnikające do zdrowych komórek.

Punktem wyjścia była biblioteka około stu związków zaprojektowanych z myślą o kaspazach prozapalnych. Szczególną uwagę zwrócił inhibitor o bardzo niskiej przepuszczalności przez nieuszkodzoną błonę komórkową, który mimo to skutecznie hamował proces zachodzący wewnątrz komórki.

– Najciekawszy etap projektu rozpoczął się od obserwacji, która początkowo nie pasowała do naszych założeń. Zamiast potraktować ten wynik jako anomalię, postawiliśmy hipotezę, że sam mechanizm pyroptozy otwiera związkowi drogę do komórki – mówi prof. Marcin Poręba.

Badacze założyli, że inhibitor przedostaje się do wnętrza przez pierwsze pory utworzone przez gasderminę D. Trafiając do środka, blokuje kaspazy, co zatrzymuje powstawanie kolejnych porów i ogranicza wyrzut cytokin. Pory stają się w ten sposób swoistą „bramą”, dostępną wyłącznie dla tych komórek, w których proces pyroptozy już się rozpoczął.

Krótkie okno terapeutyczne

Jednym z najlepiej przebadanych związków był inhibitor KGR-3, który skutecznie hamował pyroptozę indukowaną przez kaspazy-1 i -4 oraz ograniczał uwalnianie IL-1β. Nie chronił natomiast komórek przed apoptozą – inną formą programowanej śmierci komórki, w której pory gasderminy D nie powstają. Potwierdziło, że jego działanie zależy od obecności porów tworzonych przez gasderminę D.

Kolejnego argumentu dostarczyły barwniki, które nie potrafią przenikać przez nieuszkodzone błony. Naukowcy wykryli je wewnątrz komórek uratowanych przed pyroptozą. Oznaczało to, że błona została chwilowo otwarta, ale komórka nie uległa rozpadowi.

Badania wykazały również, że po zahamowaniu kaspaz uszkodzenia błony komórkowej mogą zostać naprawione przez naturalny system naprawczy komórki związany z kompleksem białek ESCRT.

Co istotne, część komórek nie tylko uniknęła śmierci, ale odzyskała zdolność do dalszego wzrostu i podziałów. Działanie ochronne obserwowano nawet wtedy, gdy inhibitor podawano kilka godzin po rozpoczęciu pyroptozy. Oznacza to, że między powstaniem pierwszych porów a rozpadem komórki istnieje krótkie okno terapeutyczne, w którym możliwe jest zatrzymanie całego procesu.

Skuteczność potwierdzona w modelu in vivo

Kolejny badany związek – KGR-53P – przeszedł pomyślnie testy na mysich komórkach układu odpornościowego. Następnie został sprawdzony w badaniach in vivo w mysim modelu szoku endotoksycznego. Zwierzętom podano bakteryjny lipopolisacharyd, który wywołuje bardzo silną reakcję zapalną. U myszy otrzymujących KGR-53P stężenia IL-1β i IL-18 we krwi były wyraźnie niższe. Eksperyment ten potwierdził, że cząsteczka słabo przenikająca do zdrowych komórek jest w stanie wykorzystać pory gasderminy D w żywym organizmie i efektywnie wygasić reakcję zapalną.

To dopiero początek

Autorzy podkreślają, że odkrycie nie oznacza opracowania gotowego leku.

– KGR-3 i KGR-53P są związkami badawczymi wymagającymi dalszej optymalizacji. KGR-53P był szybko usuwany z organizmu, a zaobserwowaliśmy również wzrost poziomu enzymów wątrobowych, choć nie wiadomo jeszcze, czy był on związany z oddziaływaniem związku na inne cele molekularne – wyjaśnia prof. Marcin Poręba.

Zdaniem autorów największe znaczenie ma sama strategia selektywnego dostarczania inhibitorów do komórek, w których rozpoczęła się pyroptoza. W przyszłości może ona znaleźć zastosowanie w badaniach nad terapiami chorób związanych z nadmierną reakcją zapalną, takich jak sepsa, zespół ostrej niewydolności oddechowej czy COVID-19.

Wszystko zaczęło się na Wydziale Chemicznym PWr

Chemiczna i enzymologiczna część projektu została zrealizowana na Wydziale Chemicznym Politechniki Wrocławskiej. To tutaj opracowano koncepcję inhibitorów, przygotowano bibliotekę związków oraz zbadano ich oddziaływanie z kaspazami. 

Podstawę pod dalsze kroki dały inhibitory stworzone przez dr inż. Katarzynę Groborz podczas jej doktoratu na PWr. Jej promotorem był prof. Marcin Drąg, a promotorem pomocniczym prof. Marcin Poręba. Zdobyte podczas doktoratu doświadczenie z chemii biologicznej, enzymologii i badania śmierci komórkowej wykorzystała później w pracach prowadzonych w Genentech.

– Najważniejszym odkryciem projektu było wykazanie, że pyroptozę można zatrzymać nawet po jej rozpoczęciu. Pokazaliśmy istnienie krótkiego okna terapeutycznego, w którym zahamowanie kaspaz przerywa ten proces i pozwala komórkom odzyskać zdolność do dalszego wzrostu i podziałów. Wykorzystanie porów tworzonych przez gasderminę D umożliwiło selektywne dostarczanie inhibitorów do komórek, w których pyroptoza już się rozpoczęła. Projekt łączył kilka dyscyplin naukowych – od chemii biologicznej, przez biologię komórki, po badania in vivo – mówi dr Katarzyna Groborz, która odegrała kluczową rolę w realizacji projektu, prowadząc badania komórkowe. Dlatego w publikacji jej afiliacją jest amerykańska firma.

Zespół z Genentech odpowiadał m.in. za zaawansowane modele komórkowe, badania farmakokinetyczne, przygotowanie związków do podania oraz eksperymenty na zwierzętach.

Prace prowadzone przez zespół z PWr były finansowane przez Narodowe Centrum Nauki w ramach grantu Opus prof. Marcina Poręby „Badanie mechanizmów proteolitycznych w pyroptozie, programowanej śmierci komórki, wywołującej reakcję zapalną”.