MINIATURA 8 nr umowy DEC-2024/08/X/NZ1/00915
Tytuł projektu: Analiza zdolności trzech podtypów receptora kwasu 9-cis-retinowego do tworzenia kondensatów w komórce
Kierownik projektu: dr inż. Katarzyna Sołtys
Dofinansowanie: 44 000,00 PLN
Okres realizacji: od 2024-10-11 do 2025-10-10
Opis projektu: Celem projektu jest porównanie i zbadanie właściwości kondensatów trzech podtypów ludzkiego RXR w komórce oraz poznanie roli inherentnie nieuporządkowanych regionów AB w tym procesie. Pierwszy etap badań będzie polegał na ekspresji rekombinowanych białek (dla każdego podtypu RXR: białko pełnej długości, mutant delecyjny pozbawiony regionu AB, region AB, ABDBD) w fuzji z białkiem fluorescencyjnym EYFP w komórkach COS7. Warunki hodowli i transfekcji komórek zostały już zoptymalizowane dla każdego białka. Następnie zbadane zostaną właściwości kondensatów RXR (rozmiar, liczba) w komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Wstępne badania pokazują, że każdy podtyp RXR ma zdolność do tworzenia charakterystycznego punktowego wzoru w obecności kwasu 9-cis-retinowego (9cRA) (Rys1). Uzyskane wyniki świadczą o posiadaniu przeze mnie odpowiedniego warsztatu badawczego do realizacji niniejszego zadania badawczego. W celu określenia właściwości biofizycznych kondensatów RXR, w tym ich dynamiki, zostaną przeprowadzone eksperymenty odzyskiwania fluorescencji po fotoblaknięciu (FRAP). Analizując uzyskane dotychczas wyniki uważam, że utworzone punkty mogą tworzyć transkrypcyjnie aktywne kondensaty. W celu zbadania kolokalizacji regionów aktywnych transkrypcyjnie i kondensatów RXR, kolejny etap badań zakłada użycie przeciwciał skierowanych do ufosforylowanej polimerazy RNA II czy acetylowanych histonów (H3K27ac). Dodatkowo, projekt zakłada wykorzystanie qRT-PCR do monitorowania ekspresji genów pod kontrolą homodimerów RXR (np. genu inhibitora kinazy zależnej od cyklin p21). Realizacja zadania ułatwi zrozumienie mechanizmu tworzenia kondensatów RXR, przybliży ich rolę w regulacji transkrypcji genów i stanie się punktem wyjścia do kolejnych projektów badawczych.